Limites des méthodes de recherche des anticorps anti-HLA par technique Luminex® “Single Antigen“

La recherche et l'identification des anticorps (Ac) anti-HLA par la technologie Luminex® ont représenté une avancée majeure dans le domaine de la transplantation. La technologie Luminex® “Single Antigen” est rapidement devenue la méthode de référence en raison de sa sensibilité et de sa résolution. Elle n'est cependant pas dénuée de limites, et une connaissance de celles-ci est primordiale afin d'optimiser la prise en charge des patients.

Les interférences positives

Interférences médicamenteuses

L'administration d'immunoglobulines polyvalentes intraveineuses est connue pour entraîner une positivité de la quasi-totalité des billes du “Single Antigen” (1). Les préparations contiennent en effet des Ac anti-HLA (Human Leukocyte Antigen) gênant grandement l'interprétation des profils, en particulier lors du suivi d'Ac de faible intensité de fluorescence (Mean Fluorescence Intensity [MFI]).

Antigènes dénaturés

L'existence d'Ac anti-HLA d'isotype immunoglobuline M (IgM) “naturels”, c'est-à-dire détectés chez des donneurs de sang n'ayant jamais connu d'événement allo-­immunisant, est connue depuis les années 1970. Des Ac naturels anti-HLA d'isotype IgG ont été récemment mis en évidence avec le “Single Antigen” chez ce même type de sujets (2). Plusieurs hypothèses expliqueraient leur existence, comme une réactivité croisée entre des épitopes présents sur le HLA et chez certains micro-­organismes, sur des protéines alimentaires ou allergènes, ou bien une autoréactivité contre HLA-E.

Les Ac naturels reconnaissent les molécules HLA sous leur forme native (anti-nHLA) ou dénaturée (anti-dHLA). Les molécules HLA dénaturées ont une conformation anormale, par exemple pour la classe I liée à la perte du peptide et de la β-2 microglobuline, et sont présentes en quantité significative à la surface des billes “Single Antigen” (3). Leur origine n'est pas clairement identifiée, mais les contraintes imposées aux molécules HLA par les procédés de purification des antigènes puis de leur fixation sur les billes seraient impliquées.

Sachant qu'il est impossible de différencier les Ac anti-dHLA des anti-nHLA sur la base de la MFI du test Luminex® ou des spécificités antigéniques reconnues et que ce phénomène touche les réactifs en provenance des 2 fournisseurs qui existent sur le marché, il est nécessaire d'utiliser des examens complémentaires pour identifier les Ac anti-dHLA. La méthode la mieux décrite pour la classe I consiste à traiter les billes avec un tampon acide (pH < 3), ce qui entraîne une dénaturation particulière et sans doute artificielle (par rapport à la forme naturelle) des molécules HLA. La présence d'Ac anti-dHLA est suspectée si les MFI augmentent de façon significative après le traitement acide. Cependant, ce test ne permet pas d'exclure l'existence d'Ac reconnaissant d'autres formes de dénaturation et donne parfois lieu à des réactions faussement positives (4). Néanmoins, son utilisation a permis de montrer que les Ac anti-dHLA sont très fréquemment détectés par le “Single Antigen” de classe I, touchant près de 40 % des patients immunisés en classe I inscrits sur liste d'attente (5).

En revanche, l'existence d'Ac anti-dHLA dirigés contre des antigènes de classe II est plus controversée. Morales-Buenrostro et al. ont estimé à 23 % la prévalence des Ac anti-HLA de classe II “naturels” dans leur cohorte de sujets sans événement immunisant (2), mais cette étude n'utilisait pas de test cellulaire permettant de vérifier la capacité de ces Ac à reconnaître ou pas des molécules HLA natives. Grenzi et al. se sont intéressés à un profil particulier récurrent obtenu avec le “Single Antigen” de classe II (6). La réalisation du test de compatibilité donneur/receveur (le crossmatch cellulaire) par cytométrie en flux (CMF) montrait que les Ac qui le composaient n'étaient pas capables de lier des cellules humaines. Le traitement acide des billes de “Single Antigen” de classe II ne permettait pas de conclure quant à leur reconnaissance de molécules HLA de classe II dénaturées.

Le fournisseur One Lambda a également proposé les iBeads®, correspondant à des billes “Single Antigen” de classe I traitées par des procédés enzymatiques permettant de retirer tout ou partie des molécules HLA dénaturées de leur surface (3, 7). Cela permettait de diminuer leur sensibilité aux anti-dHLA, et les résultats publiés semblaient très prometteurs, mais les iBeads® ne sont plus commercialisées depuis plusieurs années.

Au contraire des anticorps anti-HLA natif, la signification clinique des Ac anti-dHLA est considérée comme négligeable, un certain nombre de publications rapportant que ceux-ci ne positivent pas les crossmatchs (XM) et n'ont aucun impact sur le rejet ou la survie du greffon (3, 8). Ils ne devraient donc pas être pris en compte dans les stratégies d'attribution des greffons étant donné qu'ils peuvent réduire l'accès à la greffe de manière injustifiée, voire drastique si le nombre de spécificités antigéniques est important et/ou si ces spécificités sont fréquentes dans la population des donneurs (5). Cependant, la distinction antinatif/dénaturé n'est pas réalisée en pratique courante.

Les interférences négatives

Des phénomènes d'interférence négative conduisant à la sous-estimation, voire à la non-détection des Ac anti-HLA en “Single Antigen” ont également été rapportés. Les premiers articles relataient une interférence réversible par traitement du sérum au dithiothréitol (DTT) ou après dialyse hypotonique, laissant penser à des interférences liées à des IgM anti-HLA entrant en compétition avec les IgG. L'effet “prozone” – terme provenant de l'homologie observée avec l'interférence bien connue des réactions d'agglutination – a ensuite été décrit pour les IgG de forte MFI (9). L'effet “prozone” est réversible par traitement du sérum à l'acide éthylène diamine tétra-acétique (EDTA), au DTT, à la chaleur (56 °C pendant 30 mn) ou par dilution. La première hypothèse était que l'association des fragments C1r et C1s au C1q empêchait la fixation du conjugué (immunoglobulines anti-IgG humaines) fluorescent de révélation du test “Single Antigen” de l'anti-IgG fluorescent par encombrement stérique. Il a ensuite été démontré que l'interférence était liée à l'accumulation des produits d'activation des facteurs du complément C4 et C3 à la surface des billes, cachant le fragment Fc de l'Ac anti-HLA du patient au conjugué (10). Cette interférence due au complément est principalement observée lors de l'utilisation des kits provenant du fournisseur One Lambda (9-11), alors que de rares cas ont été rapportés pour les kits Immucor. Elle est d'autant plus importante (donc la détection de l'Ac, plus compromise) que la densité des Ac à la surface des billes est importante. La fréquence de non-détection des IgG de très haute MFI a été estimée à 2,1 % en classe I et 1,1 % en classe II (11), alors que la simple sous-estimation de la MFI toucherait 10 à 30 % des patients (12). Cette interférence explique également les fluctuations de profil “Single Antigen” observées chez certains patients fortement immunisés (11). La description de l'interférence liée au complément a soulevé la question de l'existence de l'interférence liée aux IgM. Cette dernière existe vraiment, mais serait moins fréquente (13).

Les conséquences cliniques de ces interférences négatives peuvent être importantes, voire graves, que ce soit en situation prégreffe, notamment lorsque le XM n'est pas réalisé avant la transplantation (transplantation non rénale, XM virtuel), ou en situation post-greffe où un authentique rejet humoral pourrait être négligé. La Société francophone d'histocompatibilité et d'immunogénétique (SFHI) recommande de traiter les sérums afin de s'affranchir de l'interférence liée au complément. Actuellement, plus de 85 % des laboratoires français utilisent les kits One Lambda et plus de 90 % d'entre eux réalisent un prétraitement (84 % par ajout d'EDTA, 8 % par ajout de DTT, données SFHI 2016).

La standardisation du test “Single Antigen”

La littérature scientifique et les travaux de la SFHI mettent en évidence des disparités entre laboratoires concernant la définition des spécificités HLA positives (14, 15), d'ordre technique ou d'ordre analytique, vis-à-vis desquelles un travail de standardisation est nécessaire. Le groupe de travail “anticorps en transplantation d'organe” de la SFHI (responsables Dr I. Jollet et Pr J.L. Taupin) a démarré fin 2017 une évaluation nationale à l'aide d'un contrôle de qualité interne externalisé sous la forme de sérums qui seront intégrés dans le fonctionnement de routine des laboratoires y participant.

Standardisation technique

Variabilité interfournisseurs

Lors d'une étude réalisée à partir des résultats d'évaluation externe de la qualité de l'ASHI (American Society for Histocompatibility and Immunogenetics) suivie par 124 laboratoires entre 2010 et 2013, Israeli et al. ont décrit un nombre non négligeable de spécificités n'atteignant pas le consensus en classe 1 (entre 2 et 19 spécificités) ou en classe 2 (entre 1 et 4 spécificités) [15].

Plusieurs facteurs pourraient expliquer ces différences. Premièrement, les panels d'antigènes HLA proposés sont différents. Par exemple, les spécificités B59 et B67 étant non représentées dans l'une des 2 trousses utilisées, l'assignation de ces spécificités est impossible pour les laboratoires qui l'emploient. Deuxièmement, une différence de densité antigénique à la surface des billes conduirait à des variations de la MFI mesurée. Troisièmement, les différences entre les procédés de fixation des molécules HLA sur les billes influeraient sur la proportion de molécules dénaturées à la surface des billes selon les allèles, et donc sur la proportion et la force des réactivités faussement positives. Quatrièmement, Immucor impose une dilution au 1/5 du sérum, ce qui entraînerait une sensibilité inférieure mais potentiellement une meilleure spécificité. Enfin, le calcul destiné à la normalisation des MFI est très différent entre les 2 fournisseurs.

Ainsi, les études successives de la SFHI (groupe de travail “anticorps en transplantation d'organes”) de comparaison interlaboratoires menées depuis 2009 montrent des MFI brutes systématiquement plus faibles avec les réactifs Immucor, en moyenne à 38 % de celles obtenues avec les réactifs One Lambda pour la classe I, et à 70 % pour la classe II (dernier exercice en date de mai 2017), les calculs de normalisation ne compensant que partiellement ces résultats.

Variabilité intrafournisseur

Deux études du même groupe de travail SFHI, conduites en 2012 et 2014, ont comparé les MFI obtenues par les utilisateurs des réactifs One Lambda. Les coefficients de variation (CV) interlaboratoires retrouvés étaient de l'ordre de 30 %. En intralaboratoire, la reproductibilité était meilleure (CV < 20 % pour 43 % des laboratoires en 2012 et pour 72 % des laboratoires en 2014).

Les variabilités intrafournisseur peuvent être expliquées par l'utilisation de lots différents de billes ou du conjugué fluorescent (14) et l'hétérogénéité des protocoles techniques utilisés par les laboratoires (14). Enfin, la méthode n'étant pas automatisée et faisant intervenir plusieurs étapes d'incubation, d'agitation et de lavages, le facteur humain a également été identifié comme jouant un rôle important. Il appartient donc à chaque laboratoire de s'efforcer de limiter les variations d'ordre technique par l'observation des bonnes pratiques de laboratoire et des recommandations de la SFHI. Parallèlement à ces études SFHI, un travail ponctuel américain rapportait une variabilité interlaboratoires de l'ordre de 60 %, ramenée à environ 20 % (14) après normalisation des conditions opératoires et des techniques. Cette variabilité atteignait 30 % en France selon le groupe de travail SFHI sur 5 années, et ce dans les conditions usuelles d'utilisation par les 20 à 25 participants (Inter- and intra-laboratory reproducibility among French HLA laboratories using the One Lambda class I Single Antigen Flow Bead assay: a nation-wide SFHI study [P255, EFI conference 2015-Genève]), donc sans imposer de protocole opératoire unique.

Standardisation de l'interprétation des profils d'anticorps

Deux études conduites par le même groupe de travail SFHI en 2009 puis en 2013 auprès de 20 laboratoires français et portant sur la seule interprétation de 10 profils MFI en “Single Antigen” obtenus dans un laboratoire de référence avaient révélé des différences importantes d'assignation des spécificités interdites ou permises. En 2009, cela se traduisait par un accès à la greffe différant d'un facteur 2 à 50 selon les profils et les équipes. En 2014, les mêmes profils réanonymisés différemment avaient été reproposés en aveugle, et les différences d'interprétation par rapport à 2009 étaient marginales (données non publiées). Dans cette étude, les disparités étaient seulement liées à l'utilisation de seuils et de modalités d'interprétation des profils “Single Antigen” différents.

Seuils de MFI

Outre les problèmes de standardisation des MFI inter- et intralaboratoires, il existe une variabilité importante de l'interprétation des données “brutes” obtenues avec les tests “Single Antigen”. Le seuil de “positivité” biologique c'est-à-dire de définition de la présence d'un Ac, ou clinique c'est-à-dire à partir duquel le résultat peut avoir une conséquence pour le patient ou sa prise en charge n'est pas identique pour tous les laboratoires et leurs équipes de greffe, et peut de plus varier en fonction de la situation prégreffe et postgreffe.

En situation prégreffe, une MFI au maximum égale à 500 obtenue avec la technique One Lambda a été définie par le groupe de travail HLA de l'Agence de la biomédecine (ABM) en 2009 pour définir les “antigènes permis” lors de l'attribution des greffons rénaux, c'est-à-dire les antigènes contre lesquels il est admis qu'un receveur ne possède aucune immunisation. En parallèle, une MFI supérieure à 1 000 ou 2 000 génère souvent un XM positif en méthode sensible telle que la CMF.

En situation postgreffe, la MFI des Donor-Specific Antibodies (DSA) de novo n'est pas non plus clairement associée à la survenue d'épisodes de rejet humoral ou de perte du greffon. Ainsi, chaque laboratoire alerte les cliniciens de la présence de DSA suivant un seuil de MFI défini localement et parfois même différent selon le type d'organe transplanté.

Anticorps non dirigés contre les produits des gènes HLA-A, -B, -DRB1 et -DQB1

Le “Single Antigen” permet la détection des Ac anti-HLA dirigés contre les produits des gènes HLA-A, -B, -DRB1, -DQB1 mais aussi HLA-C, HLA-DPB1, HLA-DPA1, HLA-DQA1, HLA-DRB3/4/5. Cependant, il a été démontré que les Ac ciblant ce dernier groupe d'antigènes peuvent conduire au rejet du greffon, sauf pour HLA-DPA1 pour lequel aucune donnée n'a été publiée. Ainsi, la prise en compte de ces Ac diffère selon les centres et parfois même selon le statut immunologique du receveur.

En situation prégreffe, une autre source de variabilité lors de la saisie des antigènes interdits dans le dossier immunologique Cristal est liée à la prise en compte des déséquilibres de liaison existant entre les gènes HLA-B et -C, HLA-DRB1 et -DRB3/4/5, ainsi que HLA-DRB1, -DQB1 et -DQA1. En effet, certains centres ont pris le parti d'interdire les antigènes HLA-B et/ou -DRB1 en déséquilibre de liaison avec les antigènes HLA-Cw, DR51/DR52/DR53 et -DQalpha afin de limiter les propositions de greffons pour un receveur présentant une forte immunisation contre ces derniers. La SFHI recommande désormais la prise en compte des déséquilibres de liaison connus entre HLA-DRB1 et HLA-DRB3/4/5 ou HLA-DQA1 pour affiner la liste des antigènes à interdire dans Cristal.

Anticorps dirigés contre des allèles HLA

Certains antigènes étant représentés par différents allèles dans les trousses “Single Antigen”, il est fréquent d'observer des immunisations spécifiques d'allèles. Face à ces Ac, l'attitude du biologiste peut varier, certains interdisant d'emblée la spécificité antigénique, d'autres prenant en compte la fréquence du/des allèles incriminés. Par exemple, en cas de positivité d'une bille B*27:03 ou B*27:08 (allèles peu fréquents dans la population caucasienne) et de négativité de la bille B*27:05 (allèle le plus fréquent), certains laboratoires interdisaient l'antigène B27 et d'autres, non. La SFHI recommande, en se basant sur le rapport bénéfice/risque, de ne pas interdire la spécificité antigénique dans son ensemble dans ce genre de situation, pour ne pas pénaliser abusivement un patient à cause d'une réactivité Ac qui sera très rarement rencontrée avec les donneurs portant cet antigène. On comprend facilement l'impact majeur que peut avoir cette réflexion pour des antigènes fréquents dans la population et possédant des allèles fréquents et rares.

Conclusion

Aussi puissante que soit une technique, il est nécessaire d'appréhender ses points forts et surtout ses points faibles pour une utilisation optimale au service des patients. La connaissance des causes de faux positifs et faux négatifs touchant le “Single Antigen” permet de mettre en place les moyens d'y remédier et de renforcer le pouvoir diagnostique et pronostique de ce test. En parallèle, l'effort commun des biologistes de la SFHI concernant la standardisation technique et d'interprétation¹ contribue à l'équité d'accès à la greffe et de prise en charge des patients transplantés sur l'ensemble du territoire français.■