Dossier

Apport de la métagénomique au diagnostic des encéphalites infectieuses : une observation exemplaire

Mis en ligne le 03/06/2018

Auteurs : A. Paugam, F. Ariey

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  • Le résutat d'une analyse par séquençage haut-débit (SHD) peut être obtenu en moins de 3 jours.
  • La métagénomique permet d'identifier de nouveaux agents infectieux (virus).
  • La métagénomique permet d'identifier des agents infectieux pour lesquels une PCR spécifique a été mise en défaut en raison de variations génomiques de souches d'origines différentes.
  • En cas d'épidémie locale, la comparaison du séquençage de la totalité des génomes des isolats est plus discriminante que le typage des isolats avec les techniques conventionnelles.
  • La collaboration internationale concourt à la constitution de banques communes qui permettront une détection plus précoce des phénomènes épidémiques à l'échelle mondiale (exemple du virus Zika).

Depuis une dizaine d'années, les nouvelles techniques de séquençage à haut débit (SHD) sont de plus en plus utilisées pour un dia­gnostic microbiologique au lit du malade. La métagénomique est une des utilisations du séquençage haut-débit qui a pour but l'analyse de l'ensemble des génomes contenus dans un même prélèvement (sérum, LCS, etc.). Elle permet ainsi d'identifier tous les ADN (virus, bactéries, champignons, parasites), ARN (virus) des microorganismes présents, sans hypothèse diagnostique préalable (Unbiased Pathogen Detection). Principalement mises en œuvre dans la détection des encéphalites des patients immunodéprimés, les techniques diagnostiques conventionnelles ayant échoué, ce nouvel outil diagnostique a permis la découverte de nouveaux virus et l'identification d'agents pathogènes insoupconnés. Après avoir énoncé sommairement les principes et les limites de cette méthode, nous décrirons, à l'aide d'un cas clinique caractéristique, la mise en œuvre de la technique au lit du malade, et nous discuterons des perspectives attendues.

Méthode

Principe du séquençage haut-débit

Le SHD (High Throughput Sequencing ou NGS pour Next Generation Sequencing) a été introduit il y a une dizaine d'années pour différencier les nouvelles techniques de séquençage de la méthode de référence dite “Sanger”, utilisée depuis plus de 20 ans. Cette technique princeps, longue et coûteuse permet, par session (run), le séquençage, par synthèse, d'un millier de nucléotides d'ADN au maximum. Les nouveaux séquenceurs, dits de deuxième ­génération, ont commencé à être utilisés dès 2011. Ils permettent, à moindre coût, en un seul run, de séquencer, en parallèle, plusieurs centaines de millions de nucléotides d'ADN. Le SHD nécessite 3 étapes (figure) :

  • la constitution d'une banque d'ADN : les acides nucléiques de l'échantillon (colonie bactérienne, prélèvement biologique comme le LCS, sang, selles, etc.) sont extraits, fragmentés et filtrés (la taille requise est dépendante du séquenceur utilisé) puis amplifiés par PCR ce qui permet la ligation d'adaptateurs sur tous les fragments. Les adaptateurs permettent la fixation des fragments sur la cellule de lecture (flow cell);
  • la lecture de la banque, par séquençage multi-­paraléllisé automatisé. L'idenfication des bases constituant les séquences se fait par synthèse, par PCR, lors de l'incorporation successive des bases complémentaires des fragments à séquencer. Les séquences obtenues (quelques centaines de paires de bases) sont appelées reads ;
  • l'alignement (Mapping) : c'est la recherche bio­­informatique des microorganismes correspondant aux reads. Les reads sont alignés sur les séquences connues des banques de données afin de trouver des similarités permettant leur identification. Lorsque les reads ne correspondent pas à un microorganisme connu (nouveau virus), l'assemblage de novo est utilisé. Il permet de construire sans a priori des séquences plus longues (contigs) à partir des reads puis de les comparer aux séquences annotées des banques de données (1). La constitution de la banque est considérée comme une étape essentielle pour la qualité du résultat (2). Selon les automates, trois techniques de SHD sont utilisées : le pyro­séquençage (Roche®), celle dite des terminateurs réversibles (­Illumina®) et celle dite de la ligation (Applied Systems®). Le séquençage de tous les acides nucléiques (ADN, ARN) de l'échantillon constitue une analyse dite métagénomique complète (séquençage pan­­génomique), alors que lorsqu'il ne concerne que les ADN 16S (bactéries) ou ADN 18 S (champignons) il s'agit d'une analyse métagénomique dite ciblée.

Limites du SHD

Séquencer un échantillon constitué d'ADN de plusieurs microorganismes associés à de l'ADN humain nécessite beaucoup plus de puissance que celle nécessaire au séquençage du génome d'un microorganisme isolé. L'ADN humain augmente le temps de réalisation de l'analyse et en diminue la sensibilité. Différentes méthodes dites “d'enrichis­sement” visant à supprimer l'ADN humain dans l'échantillon sont ­utilisées : méthylation, lyse ­sélective, etc. La fréquence des contaminations, par des microorganismes de l'environ­nement, des réactifs utilisés pour ­l'extraction et l'amplification des acides nucléiques, rend nécessaire la confirmation de l'isolement de l'agent putatif par une PCR spécifique (3). En cas de nouveau virus, la PCR peut être complétée par une mise en évidence in situ par microscopie électronique. L'interprétation de la signification des microorganismes identifiés et de leurs proportions respectives (microbiome) pose, d'une part, le problème de la définition de la flore microbienne normale et, d'autre part, le problème des contaminations (4). Actuellement, en France, aucun laboratoire ne propose, hors protocole de recherche, un diagnostic par métagénomique en cas d'encéphalite.

Observation

Le cas était celui d'un garçon de 14 ans atteint d'un syndrome immunitaire combiné sévère (déficit en adénosine désaminase) compensé partiellement par une allogreffe de moelle et l'administration mensuelle d'immunoglobulines IV, présentant une encéphalite fébrile chronique ayant nécessité 3 hospitalisations sur une période de 4 mois (5). Sur le LCS avaient été réalisées les PCR virales suivantes : entérovirus, VZV/HHV6/HHV8, ­JCV/­BKV/­HHV7, adénovirus/CMV/EBV, HSV1,2, HTLV, HIV, RSV, West Nile virus, Powassan virus, California encephalitis virus, St Louis encephalitis virus, Venezuela equine ­encephalitis virus, Western equine encephalitis virus ; les PCR bactériennes suivantes : Mycoplasma pneumoniae, Bartonella, Borrelia burgdorferi, 16S ADNr (x 2) ; une PCR Toxoplama et les antigènes Histoplasma/Blasto­myces, Cryptococcus, Aspergillus, et une culture bactérienne. Sur une biopsie cérébrale avait été réalisées : des PCR entéro­virus, EBV, VZV ; une culture bactérienne ainsi qu'une étude histologique (colorations fongique, bactérienne pour mycobactéries et spirochètes) et une étude par microscopie électronique. Tous ces examens étaient négatifs. Au cours des hospitalisations successives, des traitements d'épreuve avaient été introduits : cotrimoxazole, céphalosporines puis rituximab, mais aucun de ces traitements n'avait eu d'effet sur l'évolution. Finalement, en raison d'un taux élevé d'antigène carcino-
embryonnaire (ACE) dans le LCS associé à un aspect histologique inflammatoire des lepto­méninges (histologie, imagerie par IRM et scanner cérébral), un diagnostic de neurosarcoïdose était porté, faisant introduire un traitement par corticoïdes IV associé à une administration d'adénosine désaminase pour compenser le déficit enzymatique du patient. Malgré le traitement, l'état du patient s'aggravait : apparition d'un syndrome confusionnel et de crises d'épilepsie. La survenue d'une hydrocéphalie fébrile nécessitait une mise sous anesthésie générale et une antibiothérapie à large spectre était introduite (céfépime et vancomycine). Devant un tel tableau, les parents, à la demande de l'équipe médicale, donnèrent leur autorisation pour que leur fils soit inclus dans une étude d'évaluation diagnostique par analyse métagénomique. L'étude fut réalisée à partir de 4 échantillons : 2 LCS de 750 µl issus du malade (dont l'un était traité par DNase pour favoriser la recherche de virus) et 2 sérums traités par DNase, l'un issu du malade, l'autre issu d'un patient témoin. En 48 heures, les résultats permirent d'identifier une bactérie de la famille Leptospiraceae à partir du LCS (tableau I). Les temps d'analyse se décomposaient en 30 heures pour la préparation de l'échantillon et la constitution de la banque, 16 heures pour la lecture (Séquenceur Illumina MiSeq®) et 97 minutes pour ­l'analyse informatique. Cette dernière étape bénéficiait d'un traitement informatique original dit SURPI (Sequence-based Ultra Rapid Pathogen Identification). Dans un premier temps, les séquences d'origine humaine furent identifiées et soustraites (alignement dans la base de données NCBI), puis sur les reads restants la recherche de microorganismes fut ­effectuée. Sur les 3 063 784 reads issus du LCS non traité par DNase après soustraction des reads humains, seuls 52 621 (1,72 %) furent identifiés comme nonhumains. Parmi ceux-ci, 960 (1,82 %) furent identifiés comme viraux et 589 (1,12 %) comme bactériens. Parmi les 589 reads bactériens, 475 (80,6 %) permirent d'identifier le genre Lepto­spira. Dès le résultat connu, la corticothérapie fut interrompue, le patient traité par pénicilline G IV (13 millions/j). Cinq jours plus tard, une PCR ­spécifique réalisée sur le LCS à partir des reads isolés (primers Omp) permit de confirmer le diagnostic, alors que la PCR conventionnelle (primers lipL32) était négative. Une étude phylogénétique permit aux auteurs d'identifier Leptospira santarosai, espèce dont le génome avait été séquencé mais non déposé dans la banque NCBI. L'espèce L. santarosai est retrouvée en Amérique latine, Caraïbes, Taïwan. L'interrogatoire avait retrouvé, 8 mois avant les hospitalisations, une baignade en eau douce lors d'un voyage à Puerto Rico (Caraïbes) au cours duquel un des amis du malade avait présenté de la fièvre et une hématurie. L'évolution fut rapidement favorable (clinique, IRM, scanner cérébraux) et, 1 mois après la mise sous traitement, le malade put regagner son domicile.

Discussion

Cette observation illustre l'apport diagnostique du SHD. Son utilisation a permis de diagnostiquer une forme insoupçonnée de neuroleptospirose en raison d'une symptomatologie très atypique. Alors que la neuroleptospirose est considérée comme une complication aiguë survenant dans les semaines suivant la contamination, dans cette observation il s'agissait d'une forme chronique, tardive, dont les premiers symptomes se sont manifestés plus de 3 mois après le bain infestant (céphalées, uvéite, conjonctivite). Il faut souligner que si le diagnostic de leptospirose avait été suspecté, il n'aurait pas été possible de l'affirmer car la PCR conventionnelle (fournie par le CDC [Center for Disease Control]), réalisée rétrospectivement, avait été négative. Cela souligne la puissance du SHD qui permet de détecter des génomes infectieux pour lesquels, en raison d'origines géographiques éloignées du lieu du diagnostic, les PCR conventionnelles sont mises en défaut. L'espèce identifiée, L. santarosai, est génétiquement éloignée des espèces retrouvées aux États-Unis mais elle est présente en Amérique latine, aux Caraïbes, à Taïwan. C'est grâce à cette information que l'interrogatoire a pu retrouver le voyage aux Caraïbes, à Puerto Rico, lieu de la contamination. Le polymorphisme génétique qui peut varier, au sein d'une même espèce, selon l'origine géographique, permet d'identifier la circulation d'agents infectieux d'un pays à l'autre (réalisation d'arbres phylogénétiques). Le SHD est aussi un outil particulièrement utile dans le cadre d'exploration d'épidémies. Une équipe suisse a pu démontrer la puissance du SHD sur une souche de méningocoque (Neisseria meningitidis) non détectée par la PCR du CHU de Lausanne. La comparaison des gènes de cette souche avec ceux de 183 autres souches de N. meningitidis a permis d'identifier 11 gènes cibles et de développer des PCR diagnostiques spécifiques de l'espèce N. meningitidis (6). Le SHD est plus discriminant que les méthodes classiques de typage comme l'on montré Lavezzo et al. (7) lors d'une épidémie à N. meningitidis survenue dans le Nord-Est de l'Italie et concernant 7 malades. Le typage conventionnel par électrophorèse en champ pulsé et l'étude par MLST démontraient que les isolats appartenaient au même complexe clonal (ST-11), résultat confirmé par le séquençage de la région variable PorA (régions 1 et 2). Ce n'est que par le séquençage de la totalité des 7 génomes, par SHD, que les auteurs ont pu démontrer que le dernier cas diagnostiqué était différent des autres et n'appartenait pas au clone épidémique.

Concernant les virus, qui sont les agents infectieux les plus souvent responsables des ­encéphalites, dans une revue récente de la littérature, Brown J et al. ont analysé les cas d'encéphalites publiés de 2008 à 2016 pour lesquels le SHD avait été utilisé comme examen diagnostique (8). Ils ont recensé 25 articles correspondant à 44 cas. Dans 81,8 % (36/44) il s'agissait de virus (tableau II). Dernièrement (2017-2018), d'autres espèces de virus ont pu être identifiées : Cache valley virus (9), Saint Louis virus (10), Japanese ence­phalitis virus (11) et Powassan virus (12). Pour favoriser la détection virale, une innovation récente, très prometteuse, est la technique “VirCapSeq-VERT”. Elle permet de cibler la détection du virome en utilisant des sondes de cDNA biotynilées appartenant à tous les genres de virus connus pour infecter les vertébrés. Les sondes (hybridées et nonhybridées) sont ensuite récupérées à l'aide de billes magnétiques couvertes de streptavidine. Cette technique a une sensibilité comparable à celle des PCR conventionnelles. Elle augmente d'un facteur 100 à 10 000 le nombre de reads viraux obtenus par rapport aux techniques conventionnelles d'enrichissement (­filtration et nucléase) [13].

Conclusion

Les méthodes de séquençage de nouvelle génération sont en train de révolutionner le diagnostic en infectiologie. Le coût (quelques centaines d'euros) et le temps nécessaire à l'analyse (quelques jours), permettent désormais d'envisager leur utilisation dans les laboratoires hospitaliers. La méta­génomique qui permet de découvrir de nouveaux virus et des bactéries émergentes, a démontré sa puissance diagnostique par rapport aux techniques conventionnelles. Elle permet, non seulement une identification sans a priori de virus, bactéries ou parasites, mais aussi, en comparant le génome incriminé avec ceux issus de cas similaires, de mettre en évidence le caractère épidémique d'une infection et d'en retrouver rapidement la source. Les patients immunodéprimés, en bénéficiant plus systématiquement du SHD, pourraient être considérés comme des “sentinelles” car ils sont souvent les premiers touchés en cas d'infections émergentes, en particulier à arbovirus comme ceux du West Nile, ­Chikungunya, et Zika (14).■


FIGURES

Références

1. Audebert C, Hot D, Lemoine Y et al. Le séquençage haut-débit. Vers un diagnostic basé sur la séquence ­complète du génome de l’agent infectieux. Med Sciences 2014;
30:1144-51.

2. Afshinnekoo E, Chou C, Alexander N et al. Precision metagenomics: rapid metagenomic analyses for infectious disease diagnostics and public health surveillance. J Biomol Tech 2017;28:40-5.

3. Perlejewski K, Popiel M, Laskus T et al. Next-generation sequencing in the identification of encephalitis-causing viruses: unexpected detection of human herpesvirus 1 while searching for RNA pathogens. J Virol Methods 2015;226:1-6.

4. Bukowska-Osko I, Perlejewski K, Nakamura S et al. Sensitivity of next-generation sequencing metagenomic analysis for detection of RNA and DNA viruses in cerebrospinal fluid: the confounding effect of background contamination. Adv Exp Med Biol 2016. Doi: 10.1007/5584_2016_42.

5. Wilson MR, Naccache SN, Samoya E et al. Actionable diagnosis of neuroleptospirosis by next-generation sequencing. N Engl J Med 2014;370:2408-17.

6. Diene S, Bertelli C, Pillonel T et al. Génomique et méta­génomique bactériennes : applications cliniques et importance médicale. Rev Med Suisse 2014;10:2155-61.

7. Lavezzo E, Toppo S, Franchin E et al. Genomic comparative analysis and gene function prediction in infectious diseases: application to the investigation of a meningitis outbreak. BMC Infect Dis 2013;13:554.

8. Brown JR, Bharucha T, Breuer J. Encephalitis diagnosis using metagenomics: application of next generation sequencing for undiagnosed cases. J Infect 2018;76:225-40.

9. Wilson MR, Suan D, Duggins A et al. A novel cause of chronic viral meningoencephalitis: Cache Valley virus. Ann Neurol 2017;82:105-14.

10. Chiu CY, Coffey LL, Murkey J et al. Diagnosis of fatal human case of St. Louis encephalitis virus infection by metagenomic sequencing, California, 2016. Emerg Infect Dis 2017;23:1964-8.

11. Mai NTH, Phu NH, Nhu LNT et al. Central nervous system infection diagnosis by next-generation sequencing: a glimpse into the future? Open Forum Infect Dis 2017. doi.10.1093/ofid/ofx046.

12. Piantadosi A, Kanjilal S, Ganesh V et al. Rapid detection of Powassan virus in a patient with encephalitis by metagenomic sequencing. Clin Infect Dis 2018; 65: 789-92

13. Kennedy P et al. Viral encephalitis of unknown cause: current perspective and recent advances. Viruses 2017; 9: 138; Doi:10.3390/v9060138

14. Wilson MR, Zimmermann LL, Crawford ED et al. Acute West Nile virus meningoencephalitis diagnosed via metagenomic deep sequencing of cerebrospinal fluid in a renal transplant patient. Am J Transplant 2017;17:803-8.

Liens d'interêts

Les auteurs déclarent ne pas avoir de liens d'intérêts.

auteurs
Dr André PAUGAM

Médecin, Biologie médicale, Hôpital Cochin, AP-HP, Paris, France

Contributions et liens d’intérêts
Dr Frédéric ARIEY

Médecin, Pathologie infectieuse et tropicale, clinique et biologique, Hôpital Cochin, AP-HP, Paris, France

Contributions et liens d’intérêts
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